Пцр с электрофоретической детекцией. Принцип метода. Стадии.

ПЦР (полимеразная цепная реакция) с электрофоретической детекцией – это метод, который позволяет изготавливать и анализировать специфичные фрагменты ДНК. Принцип данного метода основан на амплификации целевых последовательностей ДНК, а электрофорез используется для их визуализации и анализа. ### Принцип метода Основной принцип ПЦР заключается в многократном копировании (амплификации) определенной цепочки ДНК. Процесс включает в себя три основные стадии: денатурация, отжиг и элонгация. ### Стадии ПЦР с электрофоретической детекцией 1. **Денатурация**: - На этой стадии двойная спираль ДНК разрывается, и молекулы ДНК разделяются на две одноцепочечные нити при высокой температуре (обычно 94-98°C). Это происходит за счет разрушения водородных связей между комплементарными основаниями. 2. **Отжиг (прайминг)**: - Температура снижается (обычно до 50-65°C), позволяя коротким последовательностям ДНК, называемым праймерами, связываться с одноцепочечными нитями целевой ДНК. Праймеры определяют границы амплифицируемого фрагмента и обеспечивают место для начала синтеза новой цепи. 3. **Элонгация**: - Температура увеличивается до оптимальной для работы термостабильной ДНК-полимеразы (обычно около 72°C). Полимераза начинает синтезировать новые цепи ДНК, добавляя нуклеотиды к праймерам, тем самым удваивая количество целевого фрагмента. Эти три стадии повторяются в цикле 20-40 раз, что позволяет значительно увеличить количество целевой ДНК. ### Электрофоретическая детекция После завершения амплификации полученные продукты ПЦР анализируются с использованием агарозного геля. 1. **Приготовление геля**: - Агарозный гель готовится и заливается в кассету с образовавшимися после застывания ячейками. 2. **Загрузка образцов**: - Амплифицированные фрагменты ДНК смешиваются с буфером и загружаются в ячейки геля. 3. **Электрофорез**: - Применяется электрическое поле, что заставляет молекулы ДНК мигрировать по гелю. Молекулы движутся в зависимости от их размера: меньшие фрагменты двигаются быстрее, чем более крупные. 4. **Визуализация**: - После окончания электрофореза гель окрашивается с помощью красителей (например, этидий бромид) и визуализируется под ультрафиолетовым светом. Это позволяет оценить размер и количество амплифицированных фрагментов ДНК, что помогает в определении наличия целевой последовательности. Используя данную схему, метод ПЦР с электрофоретической детекцией становится мощным инструментом для диагностики, генетических исследований и других применений в молекулярной биологии и медицине.