Пцр с электрофоретической детекцией Стадии подробно

ПЦР (полимеразная цепная реакция) с электрофоретической детекцией представляет собой метод, используемый для амплификации и последующего анализа фрагментов ДНК. Ниже представлены основные стадии этой процедуры. ### 1. Подготовка реакционной смеси - **ДНК-шаблон**: Исходный материал, содержащий искомую ДНК. - **Продукты**: Олигомерные праймеры, специфичные к целевой области ДНК. - **ДНК-полимераза**: Фермент, который синтезирует новую ДНК-цепь. - **ДНК-нуклеотиды (dNTPs)**: Строительные блоки для синтеза новой ДНК. - **Буфер**: Создает оптимальные условия для работы полимеразы. ### 2. Реакция ПЦР Необходимые температуры для катализируемых полимеразой реакций: - **Денатурация** (94–98°C): ДНК распаивается на два одноцепочных фрагмента. - **Отжиг** (50–65°C): Праймеры связываются с комплементарными участками на одноцепочных ДНК. - **Элонгация** (72°C): ДНК-полимераза начинает синтез новой цепи ДНК, используя нуклеотиды. Процедура повторяется в циклах (обычно 25-35) для достижения необходимого количества амплифицированной ДНК. ### 3. Подготовка к электрофорезу После завершения реакции ПЦР, необходимо подготовить образцы для аналитического этапа: - **Концентрация ДНК**: Обязательно проверить, сколько ДНК было получено, используя спектрофотометр или другой метод. - **Добавление ингибитора** (при необходимости): Иногда нужно добавлять краситель, который связывается с ДНК и позволяет визуализировать результаты после электрофореза. ### 4. Электрофорез - **Приготовление геля**: Обычно используют агарозный гель, который изготавливается путем растворения агарозы в буферном растворе. - **Загрузка образцов**: Образцы ПЦР загружаются в ячейки геля. - **Согласно электрическому полю**: ДНК перемещается через гель. Молекулы меньшего размера перемещаются быстрее, в то время как большие фрагменты движутся медленнее. ### 5. Визуализация результатов - **Использование красителей**: Гель окрашивают с помощью таких красителей как этидиум бромид, SYBR Green или другие специфичные для ДНК. - **Просмотр результатов**: После окрашивания гель анализируется под ультрафиолетовым светом. Получается полоса, соответствующая размеру амплифицированного фрагмента ДНК. ### 6. Анализ данных - **Сравнение с контрольной линией**: Сравниваются наблюдаемые полосы с маркерами размерности, чтобы определить размер амплифицированных фрагментов. - **Интерпретация результатов**: В зависимости от присутствия или отсутствия полос в геле может быть сделан вывод о наличии или отсутствии целевого фрагмента ДНК. Эти стадии позволят провести ПЦР с электрофоретической детекцией и проанализировать полученные результаты.